ناقش قسم علوم الحياة في كلية التربية للعلوم الصرفة (ابن الهيثم) اطروحة الدكتوراه الموسومة ( دور فيتامينC وهرمون البراسينولايد في تحمل نبات الماش((Vigna radiata L. للاجهاد الملحي والنامي في المزارع النسيجية والحقل ) للطالب (حسن عبد الرزاق علي حسين ) التي انجزها تحت اشراف التدريسية في القسم (أ.د. وفاق امجد محمد خالد القيسي ) و ( رئيس الباحثين د. اخلاص عبد الكريم جاسم ) من دائرة البحوث الزراعية في وزارة العلوم و التكنولوجيا
ونوقشت الاطروحة من قبل السادة اعضاء لجنة المناقشة :
أ.متمرس د. عباس جاسم حسين رئيسا
أ.د. بهاء الدين مكي فيروز عضوا
أ.د. كاظم هاشم ياسين عضوا
أ.م.د. ماهر زكي فيصل عضوا
أ.م.د. فاضل عليوي عطية عضوا
أ.د. وفاق امجد محمد خالد القيسي عضوا ومشرفا
ر. ب. د. اخلاص عبد الكريم جاسم عضوا ومشرفا
ويهدف البحث الى :
-
تحديد أفضل توليفة هرمونية وجزء نباتي لاستحثاث الكالس ذات صفات تلائم استعماله في التجارب اللاحقة.
-
دراسة تاثير ملح كلوريد الصوديوم(الاجهاد الملحي) في مؤشرات نبات الماش المزروع خارج الجسم الحي وداخله.
-
دراسة تاثير فيتامينC وهرمون البراسينولايد في تحمل نبات الماش المزروع خارج الجسم الحي وداخله للاجهاد الملحي.
-
دراسة تاثير ملح كلوريد الصوديوم وفيتامينC وهرمون البراسينولايد في انتاج وتراكم المادة الفعالة في الكالس والبذور.
-
انتاج نباتات من الكالس المعرض للتراكيز الملحية المختلفة وفحص التغاير الوراثي باستعمال موشر التضاعف العشوائي المتعدد الاشكال لسلسلة الدنا ومقارنتها مع النباتات الناتجة من البذور (نسيجيا).
وتم في هذا البحث تنفيذ التجربة النسيجية في مختبر الزراعة النسيجية العائد لقسم الهندسة الوراثية / دائرة البحوث الزراعية/ وزارة العلوم والتكنولوجيا بموجب تصميم التام التعشية, كما نفذت التجربة الحقلية في كلية التربية للعلوم الصرفة(ابن الهيثم) / جامعة بغداد للموسم الزراعي2018 وفقا للتصميم القطاعات العشوائية الكاملة بهدف دراسة تاثير تراكيز كلوريد الصوديوم NaCl والفيتامين C وهرمون البراسينولايد على نبات الماش (Vigna radiata L.). شملت تجربة زراعة الانسجة تعقيم البذور واختيار الجزء النباتي المناسب لحث الكالس ضمن توليفات هرمونية مختلفة, ودراسة بعض موشرات الكالس وتقدير المادة الفعالة فيه, فضلا عن الاخلاف والتجذير ثم الاقلمة. اظهرت النتائج كالاتي:
-
ان تعقيم البذور قد تحقق باستعمال 70% كحول اثيلي لمدة 30ثانية متبوعا بـ 2% NaOCl لمدة 15دقيقة.
-
تفوق السويقتين الجنينتين العليا(Epicotyle) والسفلى(Hypocotyl) في اعطاء اعلى نسبة لاستحثاث الكالس عند التوليفة الهرمونية 0.5ملغم.لتر-1 من NAA + 2.0ملغم.لتر-1 منBA.
-
ان الكالس المزروع في وسط MS)) Murashige and Skoog المضاف اليه تراكيز NaCl(6, 9, 12, 15) ديسيسمنز.م-1 انخفض تدريجيا ومعنويا في مؤشراته المدروسة (الوزنين الطري والجاف, دليل تحمل الاجهاد الملحي, معدلي النمو المطلق والنسبي, استدامة الكتلة الحيوية, محتوى العناصر(N,P,K, Ca, Mg) ونسبة البروتين) لاسيما في التركيز 15ديسيسمنز.م-1 وبنسبة (52.41, 55.91, 55.91, 79.84, 79.78, 38.51, 68.95, 54.21, 65.63, 57.21, 71.90 , 29.51)% بالتتابع, وزيادة معنوية في النضح الالكتروليتي النسبي ومحتوى الصوديوم والكلور وتركيز البرولين وبنسبة (43.21, 41.48, 37.09, 333.67)% بالتتابع قياسا بالتركيز 6 ديسيسمنز.م-1.
-
لوحظ ان تراكيز فيتامينC (0, 20, 40)ملغم.لتر-1 وهرمون البراسينولايد (0, 0.02, 0.04) ملغم.لتر-1 سببت زيادة في مؤشرات الكالس اعلاه لاسيما التركيزين 40ملغم.لتر-1 و 0.04ملغم.لتر-1 من الفيتامين والهرمون بالتتابع.
-
لوحظ ان التداخلات الثنائية والثلاثية بين عوامل الدراسة الثلاث موثرة بصورة معنوية, واعطت التوليفة المركبة من 40ملغم.لتر-1 فيتامينC و0.02ملغم.لتر-1 براسينولايد افضل معالجة لاضرار الاجهاد الملحي لاسيما في التركيز الملحي 15ديسيسمنز.م-1.
-
اخلفت النباتات الناتجة من الكالس المعامل بالتراكيز الملحية(6, 9, 12)ديسيسمنز.م-1 على وسط MS مضافا اليه ثلاثة انواع من التوليفات الهرمونية المختلفة(2TDZ, 1.01ZE, (5BAP+ 20Adsملغم. لتر-1, ومن ثم حثها للتجذير باستعمال 1ملغم.لتر-1 من حامض اندول بيوترك(IBA), واقلمتها و زراعتها في اصص في البيت البلاستيكي وقورنت مع النباتات المستنبته من البذور النامية في وسطMS في بعض مؤشرات النمو(ارتفاع النبات, المساحة الورقية, عدد الافرع, الوزن الجاف, محتوى الكلوروفيل) ومكونات الحاصل(عدد القرنات, عدد البذور في القرنة, وزن 100بذرة).
-
تقييم الاداء الحقلي للنباتات الناتجة من الكالس المعرض لاجهاد الملحي, مع تفوق النباتات الناتجة من التركيز 6ديسيسمنز.م-1 في معظم الصفات المدروسة.
اعتمد مؤشر التضاعف العشوائي المتعدد الاشكال لسلسله الدنا للكشف عن التغايرات الوراثية للنباتات الناتجة من الكالس المعرض للاجهاد الملحي بتراكيزه المختلفة. اظهرت نتائج الدراسة الجزيئية ان مؤشر التضاعف العشوائي المتعدد الاشكال لسلسلة الدنا وجود تغاير وراثي استناداً الى عدد وحجم الحزم المتضاعفة.
شملت التجربة الحقلية دراسه استعمال مياه مالحة(كلوريد الصوديوم) بتراكيز(5.5, 10, 15)ديسيسمنز.م-1, فضلا عن معاملة السيطرة 0.9دسيسيمنز.م-1(ماء حنفيه) فضلا عن الرش بتراكيز فيتامينC (0, 60, 120)ملغم.لتر-1 وهرمون البراسينولايد (0, 2, 4)ملغم.لتر-1 وتداخلهما في تاثير بعض المؤشرات المظهرية والفسيولوجية والنمو الزهري ومكونات الحاصل والمواد الفعالة واظهرت النتائج كالاتي:
-
انخفضت الموشرات المدروسة (ارتفاع النبات, المساحة الورقية, عدد الافرع, الوزن الجاف, محتوى الكلوروفيل, نسبة الكربوهيدرات, عدد النورات الزهرية, عدد الازهار, عدد القرنات, عدد البذور في القرنة, وزن 100بذرة, حاصل البذور, نسبة البروتين في البذور) معنويا بزياده التراكيز الملحية لاسيما في التركيز 15ديسيسمنز.م-1 قياسا بمعاملة السيطرة وبنسبة(31.09, 23.88, 49.74, 33.61 ,25.49, 38.82, 36.50, 35.20, 37.09, 23.28, 32.86, 29.40, 26.18) % بالتتابع, بينما ظهرت الزيادة المعنوية في مضدات الاكسدة الانزيمية(الكاتيليز و البيروكسيديز) وغير الانزيمية(البرولين, حامض السالسيلك, فيتامينC, الفاتكوفيرول) وبنسبة (124.22, 03, 83.01, 282.87, 29.04, 13.10) % بالتتابع.
-
ادى الرش بالفيتامينC لاسيما التركيز 120ملغم.لتر-1 وهرمون البراسينولايد لاسيما التركيز 4ملغم. لتر-1 الى زيادة معنوية في جميع الصفات والمضادات الاكسدة الانزيمية وغير الانزيمية اعلاه.
-
اظهرت نتائج التداخل الثنائي والثلاثي بين عوامل الدراسة موثرة بصورة معنوية في الصفات المدروسة ومضادات الاكسدة مع تفوق النباتات المروية بماء الحنفية و المرشوشة بتركيزين من الفيتامين والهرمون (120و 2) ملغم.لتر-1 بالتتابع عن النباتات الاخرى, في حين كانت اقل القيم في النباتات المروية بالتركيز الملحي 15 ديسيسمنز.م-1 وغير المرشوشة بالفيتامين والهرمون, فيما ساهمت عملية الرش بالفيتامين والهرمون بأختزال الاثار السلبية للاجهاد الملحي لاسيما في التراكيز العالية لكلا العاملين اعلاه, مع وجود تآزر بين فيتامينC وهرمون البراسينولايد في معظم المؤشرات المدروسة.
-
استعمل جهاز الكرموتوغرافيا السائل العالي الاداء للكشف عن المواد الفعالة الموجودة في كالس وبذور الماش، اظهرت النتائج تفوق المعاملة المولفة من 15ديسيسمنز.م-1 و 40ملغم.لتر-1 فيتامينC و0.04ملغم.لتر-1 براسينولايد للكالس والمعاملة المولفة من 15ديسيسمنز.م-1 و 120ملغم.لتر-1 فيتامينC و4ملغم.لتر-1 براسينولايد للبذورفي معظم المواد الفعالة.
و اوصى الطالب في ختام اطروحته بالتوصيات الاتية :
-
اجراء دراسات على كالس محاصيل بقولية اخرى نامية ضمن ظروف ملحية واقلمتها ومتابعة نموها.
-
استثمار تقنية زراعة الخلايا المعلقة Cell Suspension Culture في انتخاب وعزل الخلايا المتحملة للملوحة.
-
اجراء تجارب وراثية للكشف عن الجينات المسؤولة عن تحمل الاجهاد الملحي والاجهادات الاخرى.
-
استعمال مركبات كيمائية اخرى(رشا او نقعا) للحد من الاثار السلبية للملوحة.
-
اجراء دراسات مكثفة على المواد الفعالة(نوعية وكمية) لنبات الماش وادراجه ضمن النباتات الطبية في الكتب والبحوث.
Role of Vitamin C and Brassinolide Hormone in Tolerance of Mung bean plant (Vigna radiata L.) for Salt Stress in Tissue Culture and Field
Hassan Abdul Razaq Ali Hussein
Supervised by Wifak A.M. Al-Kasiay and Ekhlas A.J. El-Kaaby
Abstract
In vitro experiment was conducted at the Genetic Engineering Department, Directorate of Agricultural Research / Ministry of Science and Technology according to completely randomized design and In vivo experiment was carried out in the College of Education for pure sciences (Ibn al-Haitham) / University of Baghdad during the growing season 2018 according to randomized completely block design to study the effect the concentrations of sodium chloride(NaCl), vitamin C and brassinolide hormone on the mungbean plant (Vigna radiata L.).
The tissue culture experiment included: seed sterilizing, selecting the appropriate plant part to induce the callus with different hormonal combinations, study some of the callus parameters and estimate the active compounds as well as regeneration, rooting and acclimatization.
The results showed that surface sterilization of seeds was achieved using 70% ethanol for 30second followed by 15min with 2% NaOCl.
The best callus induction in epicotyle and hypocotyle within the hormonal combination 0.5mg.l-1 of NAA and 2.0mg.l-1 of BA.
The results also showed that the callus cultured in MS media with NaCl concentrations (6, 9, 12 and 15)dS.m-1 was significantly reduced and gradated in studied parameters (fresh and dry weight, salt stress index, absolute and relative rates, biomass duration, elements content (N, P, K, Ca and Mg) and protein percentage especially at the level of 15dS.m-1 with (52.41, 55.91, 55.91, 79.84, 79.78, 38.51, 68.95, 54.21, 65.63, 57.21, 71.90 and 29.51)% respectively and a significant increase in relative electrolyte leakage, content of sodium and chloride and proline concentration with (43.21, 41.48, 37.09, 333.67)% respectively compared to the concentration of 6dS.m-1.
The vitamin C concentrations(0, 20, and 40)mg.l-1 and brassinolide hormone concentrations(0, 0.02, and 0.04)mg.l-1 caused an increase in the above callus parameters especially 40mg.l-1 and 0.04mg.l-1 concentrations of vitamin and hormone respectively.
The two and triple interactions were significant and the treatment (40mg.l-1 vitamin C and 0.02mg.l-1 hormone) was best to treat the stress (15dS.m-1).
The regenerated shoots result from callus exhibition to salt concentrations (6, 9, and 12) dS.m-1 and cultured on MS medium containing three different types of hormonal combinations (0.2 TDZ, 1.01ZE5, BAP +20Ads)mg.l-1 and then were sub cultured on MS medium supplemented with IBA 1mg.l-1 for rooting. Regenerated plantlets and were acclimatized and grown in poly-house condition to compare with plants resulting from seed which were grown in the MS media. Morphology parameters (plant height, leaf area, branches No., dry weight and chlorophyll content) and yield contents (pods No., seed No. in pod and 100seed weight) were studied.
Concerning to field performance evaluation of stressed callus derivative plants, the results revealed that plants produced from 6dS.m-1 were superior in most of parameters under studied.
Moreover, using the Random Amplified Polymorphic-DNA(RAPD) molecular marker to detect the genetic variations of the plants resulting from callus induced after salt stress. The RAPD marker results showed, a genetic variation in regenerated plants which conformed by the number and size of bands.
The field experiment included studying the use of salted water at the concentrations (5.5, 10 and 15)dS.m-1 as well as control treatment 0.9dS.m-1 (tap water) in addition to foliar application at three concentrations of vitamin C (0, 60, and 120)mg.l-1 and brassinolide (0, 2 and 4)mg.l-1 and their interaction on morphology and physiology parameters, flower growth, yield contents and active compound in seed.
Results indicated that a gradual decrease and significant effect on studied parameters(plant height, leaf area, branches No., dry weight, chlorophyll content, carbohydrates percentage, inflorescences No., flower No., pod No., seed No. in pod, 100seed weight, seed yield and protein percentage) with increase of salt concentrations especially at 15dS.m-1 compare to the control treatment with (31.09, 23.88, 49.74, 33.61, 25.49, 38.82, 36.50, 35.20, 37.09, 23.28. 32.86, 29.40 and 28.16)% respectively, While a significant increase in enzymatic(catalase and peroxidase) and non enzymatic antioxidants(proline, salicylic acid, vitamin C and α-tocopherol) reached (124.22, 123.03, 83.01, 282.87, 29.04 and 13.10)% respectively.
The foliar application with vitamin C and brassinolide especially the concentrations (120 and 4)mg.l-1 respectively affected significantly on the increase of all characteristic, enzymatic and non-enzymatic antioxidants which mentioned above.
The two and triple interactions showed a significant effect on the studied parameters and antioxidants, with the superiority of plants irrigated with tap water and sprayed with 120mg.l-1 of vitamin C and 2mg.l-1 of brassinolide to other plants, while the lowest values in the plants irrigated with salt water (15dS.m-1) only. The foliar application of vitamin and hormone reduction of the negative effects of salt stress, especially in the upper concentrations of the above factors, with a synergy between vitamin and the hormone in most of the studied characteristic and antioxidants.
High Performance Liquid Chromatography (H.P.L.C) was used to detect the presence of active compounds in callus and seeds of mungbean, the results revealed (15dS.m-1 + 40mg.l-1vitamin + 0.04 mg.l-1 hormone) and (15dS.m-1 + 120mg.l-1vitamin + 4mg.l-1hormone) treatments were superior in most of active compounds for callus and seed respectively.
